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細胞轉染常用的轉染試劑很多，其中，Lipo3000深受廣大科研工作者的喜愛，那我們來看看Lipo3000細胞轉染的實驗步驟及注意事項吧！
一、實驗前準備
Lipofectamine™ 3000 轉染試劑（Thermo Fisher）、Opti-MEM（可以用無血清的培養(yǎng)基代替）
二、實驗步驟
1.接種細胞，使其在轉染時達到70–90% 匯合度。
注：對于HEK293，6孔板一般鋪50萬個細胞左右。對于PC9, 24孔板一般鋪5-10萬個細胞。由于不同細胞，生長狀況不太一樣，需要根據情況調整。
2. 使用Opti-MEM™培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine™ 3000 試 劑，充分混勻。
3.使用Opti-MEM™培養(yǎng)基稀釋DNA，制備 DNA 預混液，然后添加P3000™ 試劑，充分混勻。
4.將上面兩步溶液合在一起，混勻并孵育10-15mins。
5.將混勻后的溶液加入到細胞培養(yǎng)基中，并輕輕搖晃培養(yǎng)基，使其均勻。
6.37°C 孵育細胞 2–4 天，然后分析轉染細胞。
轉染量：
組分 | 96孔 | 24孔 | 6孔 |
DNA/孔 | 100ng | 500ng | 2500ng |
P3000TM/孔 | 0.2μL | 1μL | 5μL |
Lipofectamine™ 3000/孔 | 0.15和0.3μL | 0.75和1.5μL | 3.75和7.5μL |
三、注意事項
1.Opti-MEM需要37℃水浴鍋預熱。
2.轉染 siRNA 至細胞時，在稀釋 siRNA 時不要加入 P3000™ 試劑。
3.關于Lipo3000的用量，比如6孔板推薦用量有兩個3.75ul和7.5ul，最di看轉染xiao率，最高看細胞耐受。
4. Opti-MEM與Lipo3000預混及Opti-MEM、質粒及P3000預混，都不需要各自孵育，而且兩者混合后孵育時間最多不要超過15mins。
5.轉染中和轉染后的細胞培養(yǎng)基中最好不要含有雙抗。
對于比較好轉染的細胞，如HEK293，而且需要大量轉染的時候，可以使用PEI進行轉染，畢竟Lipo3000比較貴。例如，在做CO-IP實驗時，需要10cm皿轉染好幾種質粒，就可以用PEI進行細胞轉染。CO-IP步驟見免疫共沉淀Co-IP實驗步驟。
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